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你會看質粒圖譜嗎?

時間:2020-09-10 瀏覽次數:290

經常提質粒嗎?熟練之后,提質粒乃至質粒構建都很簡單。但是質粒圖譜你真會看嗎?小編這里有秘訣,免費分享給大家。

第yi步:首先看 Ori 的位置,了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒)。

第二步:再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記。

Ampr 水解β-內酰胺環,解除氨芐的毒性。

tetr 可以阻止四環素進入細胞。

camr 生成氯霉素羥乙?;苌?,使之失去毒性。

neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉移酶 使 G418(長那霉素衍生物)失活

hygr 使潮霉素β失活。

第三步:看多克隆位點(MCS)。它具有多個限制酶的單一切點。便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入,會導致某種標志基因的失活,而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步:再看外源 DNA 插入片段大小。質粒一般只能容納小于 10Kb 的外源 DNA 的片段。一般來說,外源 DNA 的片段越長,越難插入,越不穩定,轉化效率越低。

第五步:是否含有表達系統元件,即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號。這是用來區別克隆載體與表達載體??寺≥d體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用那種載體,還是要以實驗目的為準繩。

啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號

啟動子-促進 DNA 轉錄的 DNA 順序,這個 DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游,是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位,但啟動子本身不被轉錄。

增強子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。其作用與增強子所在的位置或方向無關。即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。/沉默子-負增強子,負調控序列。

核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖體的兩個結合位點,對于原核而言是 AUG(起始密碼)和 SD 序列。

轉錄終止順序(終止子)/翻譯終止密碼子:結構基因的zui后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列,此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區,這 2 部分共同構成 poly(A)加尾信號。結構基因的zui后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列,此位點 down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區,這 2 部分共同構成 poly(A)加尾信號。

為什么質粒圖譜上有的箭頭順時針有的箭頭逆時針?那其實是代表兩條 DNA 鏈,即質粒是環狀雙鏈 DNA,它的啟動子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上。

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