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技術文章

血漿中C的ELISA測定實驗操作步驟

時間:2020-09-02 瀏覽次數:352

一、實驗原理
 
將抗C單克隆抗體包被固相聚苯乙烯板,加入經聚乙二醇(PEG)處理的待測樣本,然后依次加入兔抗人C-IgC多克隆抗體和過氧化物酶標記的豬抗兔IsC,再加入底物2,2’-連氮-雙(3-乙基苯駢唑啉-6-磺酸鹽)(ABTS)和H2O2顯色,于酶標儀405mn處測定每分鐘光密度增加量(OD/min),以OD/min為縱坐標,C標準晶濃度為橫坐標繪制標準曲線圖,求出待測樣本中C的含量。

 
二、實驗試劑
 
1.PBSPH7.2,9mmol/L磷酸鹽緩沖液含140mmol/L NaCl。

2.PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05%Tween20,簡稱PBS-T。

3.底物溶液:100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸鈉,50mmol/L磷酸鈉,2.5mmol/L H2O2。

4.沉淀劑:①:100mL pH8.0,20mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl緩沖液中含20g PEG 4 000,0.8g Rivanol;沉淀劑②:100mLpH2.0.100mmol/L甘氨酸-HCl緩沖液中含20g PEG4000。


三、實驗步驟
 
1.用鹽和/或PEG沉淀血漿中C5:在微量反應板中加入EDTA抗凝血漿100gL,然后加人100/uL沉淀劑,用下述三種方法中任何一種沉淀血漿中C5。

① 在微量反應板中加入100uL 2mol/L HCl與100uL EDTA抗凝血漿混合,室溫5h。加入HCl后血漿pH值在1.0-1.5之間。上清用4倍體積的0.29mol/L Tris調節至pH7.1-7.4。
②在微量反應板中加入100uL沉淀劑①,室溫30min。
③ 在微量反應板中加入100uL沉淀劑②(血漿pH值在4.0-4.5之間)。室溫30min。用方法2)和方法3)沉淀C5后,上清加入4倍體積的含0.05%Tween 20 pH7,10.21mol/L Tris-HCl緩沖液,血漿被稀釋10倍。

2.用抗C單克隆抗體(McAb)包被酶標反應板:用pHl0.6,50mmol/L碳酸鈉溶液將抗CMcAb稀釋成10ug/mL,每孔加100uL,4℃ 16h。次日取出每孔加含1%(W/V)明膠的PBSl50gL,室溫lmin;然后用PBS-Tween 20洗滌一次。

3.樣本中CSa的檢測:

洗滌后的酶標板,每孔加入方法1)、2)或3)處理的血漿樣本zoot&,4℃16h,用PBS-Tween20洗滌1次,每孔加入用含0.1%明膠的PBS-T稀釋的兔抗人CSa-IgC.多克隆抗體(46ug/mL)100t&,室溫2h,用PBS-Tween20洗滌3次;每孔加入用含0.1%明膠PBS-T稀釋的過氧化物酶標記的豬抗兔IgClOOt&(稀釋前lmL過氧化物酶偶聯物內加100ul無關鼠McAb、10ul人血漿或10ul激活的人血清處理),室溫2min,每孔用PBS-Tween20洗滌4次;每孔加入底物溶液100ul,lmin后以PBS-T調零,每3min于酶標儀405nm處讀取OD值。以OD/min增加量計算過氧化物酶活性。其活性與血漿中C含量呈正相關。本法zui低檢測極限為1ng/mL,此法未檢測出正常人新鮮血漿中的C。

4. 標準曲線的繪制:取已知濃度純化的C,對倍稀釋成一系列不同的濃度(0.039-5.000ng/mL),分別加入包被有抗CMcAb的酶標板中,然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和過氧化物酶偶聯的豬抗兔IgC及過氧化物酶的底物,以PBS-Tween調零點,讀取OD40s/min增加量,以C(desarg)濃度為橫坐標,OD40s/minx 200為縱坐標繪制標準曲線。每次繪制標準曲線應取6個已知濃度的純化C。

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